負(fù)染色法(Negative stain)是一種染色方法，常用于不透光液體標(biāo)本的鏡檢。由于其染色處理過程并非針對菌體本身，故又稱“襯托染色法”、“間接染色法”。在負(fù)染色法中，標(biāo)本不需要熱固定，細(xì)胞不會因?yàn)榛瘜W(xué)藥物的影響而變形，對于不易染色的細(xì)菌或病毒也能觀察。

負(fù)染色是一種容易，快速，定性的方法，常用于檢查分離的細(xì)胞器，大分子和病毒在EM水平的結(jié)構(gòu)。但是，該方法不能夠?qū)悠愤M(jìn)行高分辨率檢測 - 這在技術(shù)上更為復(fù)雜的快速冷凍。另外，因?yàn)樨?fù)染色涉及沉積重原子，容易造成結(jié)構(gòu)假象，球形或圓柱形結(jié)構(gòu)的假象是非常常見的。然而，負(fù)染非常有用，不需要過于昂貴的技術(shù)。

樣品應(yīng)懸浮在合適的緩沖液(如10 mM HEPES或PIPES)中，1%乙酸銨或蒸餾水中。 最好不要使用磷酸鹽緩沖液或PBS，因?yàn)樗鼈兛赡軙廴揪W(wǎng)格，否則會導(dǎo)致染色后必須清洗的鹽殘留物，造成襯度的損失。 尤其是，鈾酰鹽與磷酸根離子發(fā)生反應(yīng)，產(chǎn)生細(xì)微的結(jié)晶沉淀，使沉淀物變得模糊。 [鈾離子的沉淀磷酸根離子也是在使用TEM的樣品處理過程中使用乙酸鈾酰作的潛在問題?！?/span>

MRC實(shí)驗(yàn)室Protocol：

所需材料

5%乙酸鈾酯在二水合物中

碳涂層電鍍網(wǎng)格

自鎖/鎖定鑷子

100ul PCR管

發(fā)光放電器

清潔玻璃片和培養(yǎng)皿

Whatman紙，石蠟?zāi)?/span>

相同緩沖液中的蛋白質(zhì)和脂質(zhì)體

準(zhǔn)備蛋白質(zhì)，緩沖液，管和網(wǎng)格。將網(wǎng)格放置在清潔的顯微鏡載玻片上。在實(shí)驗(yàn)室工作臺上貼下干凈的石蠟?zāi)?將任何一面浸濕紙(盡量減少干燥)。

在PCR管中混合蛋白質(zhì)和脂質(zhì)?？傮w積將取決于您必須使用多少蛋白質(zhì)。通常我混合至少20 ul;否則蒸發(fā)會大大改變鹽含量。

輝光放電：在真空室內(nèi)放置帶有柵格的頂部(碳朝上)，并拉動真空和輝光放電。如果不使用自動定時器，輝光放電30-60秒。排空后，將其置于培養(yǎng)皿中并返回實(shí)驗(yàn)室。如果沒有可用的發(fā)光放電器，則可以省略此步驟。然而，結(jié)果不會那么干凈(較少的蛋白質(zhì)會綁定，也可能更多地在網(wǎng)格上)。

將UrAc(每次20-40μl)滴入Parafilm - 每個樣品兩滴。在染色方案中，有一塊(折疊)Whatman紙用于吸收多余的污漬和洗滌網(wǎng)格緩沖液。還有另一塊Whatman，標(biāo)有貼在其上的染色網(wǎng)格。

在夾鉗中握住網(wǎng)格。將6ul蛋白質(zhì)/脂質(zhì)溶液移至網(wǎng)格上。 20-45秒后，將緩沖液蛋白溶液印跡到Whatman紙上，接觸第一次UrAc滴，立即去除多余的污漬，接觸第二次UrAc滴。等待10-30秒，然后去除UrAc(注意吸除鑷子中殘留的液體)。然后可以通過接觸一滴緩沖液來清洗網(wǎng)格，并將其過量吸收。將網(wǎng)格放在標(biāo)簽的Whatman紙上

允許網(wǎng)格干燥幾分鐘，然后放在網(wǎng)格框(注釋位置/ ID在實(shí)驗(yàn)室書)。網(wǎng)格可以立即可視化，通?？梢苑€(wěn)定數(shù)月或數(shù)年。

背景/評論

負(fù)染是一種非?？焖伲啽愕姆椒?，可視化蛋白質(zhì)，脂質(zhì)，DNA - 任何大分子復(fù)合物。對于較大的蛋白質(zhì)，復(fù)合物或連續(xù)寡聚體(例如肽或淀粉樣蛋白纖維，盡管單個亞基非常小，可以容易地可視化)是有用的。理論上最大分辨率的負(fù)染色為7A 這幾乎和cryo-EM一樣好，而且要容易得多。更典型的分辨率是15-30A通常有可能可視化數(shù)百kD的復(fù)合物(NB：簡單的計算和經(jīng)驗(yàn)表明，不可能看到單獨(dú)的蛋白質(zhì)，或者在我手中，GroEL 14mers(840kD)或網(wǎng)格蛋白三糖(600kD)小于200kD的復(fù)合物，可以在良好的網(wǎng)格上制作，但HSP60單體不能)。然而，負(fù)染色的主要缺點(diǎn)是蛋白質(zhì)固定在低pH，高離子強(qiáng)度的乳液或鈾離子層中。這并不一定會對所有的蛋白質(zhì)產(chǎn)生重大的瑕疵(對于那些已經(jīng)被cryoEM和負(fù)染所觀察到的那些蛋白質(zhì)，幾乎沒有假象)，但是基本上對蛋白質(zhì)的影響是未知的。脂質(zhì)體或脂質(zhì)管傾向于塌陷，可能來自干燥期間的高離子強(qiáng)度。

UrAc的替代染色劑是磷酸鎢酸或PTA。這可以在diH2O中達(dá)到2%，然后pH值達(dá)到7.PTA的優(yōu)點(diǎn)是pH值更為生理，對于某些事物，分辨率可能更大;缺點(diǎn)是對比度較低，我經(jīng)常遇到大染色水晶的問題，因此很難找到網(wǎng)格的染色區(qū)域。但它是一個很好的控制。如果結(jié)構(gòu)在PTA和UrAc兩者中看起來相同，那么它們不太可能是染色偽像。

操作方法：

滴染法：一般現(xiàn)將樣品用拉長的毛細(xì)吸管一滴在被膜的載網(wǎng)上，用濾紙在載網(wǎng)上吸去多余的樣品，使樣品在載網(wǎng)上僅有一層水膜而無液滴存在。在水膜未干時，再加一滴復(fù)染液在銅網(wǎng)上，然后用濾紙靠在載網(wǎng)變上吸去多余的染液，這是常規(guī)的負(fù)染方法。由于病毒在液滴的邊緣分布較多，上訴方法可能造成較多的病毒丟失，改良的方法是用毛細(xì)管在載網(wǎng)中部加1-1.5mm直徑的一小滴病毒懸液。不用濾紙吸干而任其在自然狀態(tài)下稍干后加入一小滴染液，也不用濾紙吸干，令其自然趕走。染液的密度取決于液滴的量和它的濃度，應(yīng)經(jīng)試驗(yàn)確定，此法對于一些濃度低的病毒樣品可能獲得較好的效果。

漂浮法：現(xiàn)將需負(fù)染的樣品滴幾滴在干凈的載玻片上，再將有支持膜的載網(wǎng)漂浮在樣品液滴上以沾取樣品，用濾紙吸干樣品余液使樣品在載網(wǎng)上僅有一薄層液膜，在樣品未干時即加一滴復(fù)染液的銅網(wǎng)上，用濾紙吸干多余的染液即可。也可在磷鎢酸染液液滴中加入少許提純的病毒混勻，講有膜的銅網(wǎng)漂浮在液面上沾取有病毒的染液，用濾紙靠在銅網(wǎng)吸干。

噴霧法：將樣品與染液混合，用特制的噴霧器將混合液噴灑在有膜的載網(wǎng)上。這種方法的優(yōu)點(diǎn)是樣品在載網(wǎng)上的分布十分均勻，但需要特殊的設(shè)備，故較少采用。而且染液和樣品消耗量較大，又易造成病毒的擴(kuò)散。

負(fù)染的時機(jī)十分重要，一般不應(yīng)再載網(wǎng)上的樣品完全干了之后，也不應(yīng)該在載網(wǎng)上尚有肉眼可見的水珠時著手染色。應(yīng)該在用濾紙吸干載網(wǎng)上的樣品液滴，肉眼看不見殘液，又未干燥時滴加染液。

提純的病毒在負(fù)染時最好進(jìn)行1:10-1:100倍的稀釋，炫富病毒的緩沖液應(yīng)盡可能稀一些，叫弄的緩沖液會使載網(wǎng)上產(chǎn)生許多鹽類的結(jié)晶而影響圖像的質(zhì)量。緩沖液較濃時，宜先用雙爭輝稀釋。

復(fù)燃用的載網(wǎng)支持膜(有時是碳膜)，有時因疏水性的影響沾樣后會形成一個球形液珠，用濾紙一吸即全部吸光，樣品難以附著在支持膜上，遇到這種情況，需要離子濺射儀對載網(wǎng)進(jìn)行沁水處理，改善支持膜的親水性

復(fù)燃中常遇到顆粒懸滴樣品的凝集現(xiàn)象，即生物樣品與染色劑形成電子致密的團(tuán)塊，致使無法觀察超微結(jié)構(gòu)。這種現(xiàn)象是由多種因素引起的，除了上訴支持膜疏水性影響外，還可能是懸液濃度過大，懸液中細(xì)胞碎片過多，懸液PH值不適等，可以通過對樣品稀釋，驚醒2000-5000rpm離心和調(diào)節(jié)懸液PH值到中興或偏酸性來解決。

懸液顆粒分散性差也可以用分散劑來加以解決

用0.005-0.05%牛血清白蛋白(BSA)加入提純的病毒中，加入量無嚴(yán)格規(guī)定，一般0.5ml樣品中加3-4滴即可，如效果不好可適當(dāng)怎額增加，也可直接用0.01%BSA作為離心沉淀物的懸浮液。

將桿菌肽粉末按30-50ug/ml的濃度用蒸餾水配成溶液，用來稀釋離心沉淀的顆粒標(biāo)本或按適當(dāng)比例加到需負(fù)染的樣品中取，也可以按樣品，磷鎢酸和桿菌肽等量混合在滴到載網(wǎng)上，吸干即可觀察。

除上訴兩種分散劑外，還有人采用甘油丙二醇作為分散劑，也有人用1%二甲基亞砜(DMSO)加到染液里加強(qiáng)染液的穿透力和擴(kuò)散作用，最近有人用十八(碳)烷的單分子層作為濕潤劑，使不易染色的某些生物大恩自以著色。

某些病毒對復(fù)染色液較為敏感，負(fù)染色液會破壞形態(tài)結(jié)構(gòu)，遇到這種情況，除改用其它種類的復(fù)染色液之外，還可在負(fù)染先用1%的戊二醛按比例與樣品懸液混合，固定15分鐘?；蛘咴谡礃雍螅瑢⑤d網(wǎng)票在0.1%的戊二醛液滴上進(jìn)行固定。也可以用四氧化e整齊xun蒸固定然后在做負(fù)染。

滴樣后用雙蒸水進(jìn)行適當(dāng)清洗，可以有效地改善負(fù)染效果。尤其是使用醋酸鈾做負(fù)染色液時，應(yīng)盡量洗掉樣品中的緩沖液鹽、組織汁液等，以免與負(fù)染液反應(yīng)產(chǎn)生沉淀。經(jīng)固定后的樣品必須經(jīng)過清晰，對直接取自蔗糖密度梯度或氯化銫密度梯度離心沉淀帶的炫富樣品，沾取后雙蒸水適當(dāng)清洗后，就可直接負(fù)染觀察。

觀察負(fù)染色的生物樣品時，電鏡應(yīng)使用最小的武警光瀾，以增大反差。加速電壓可稍高一些，也增加電子的穿透能力。盡量避免電子束的長時間照射，一般在 3-4萬倍的放大倍率下照像，均可獲得高分辨率的電鏡圖像。